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NAR | 破解60年难题！周小龙团队实现RNA定点高效乙酰化修饰
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iMedicines RNA乙酰化是一种普遍存在于各种RNA中的转录后修饰。 细菌甲硫氨酸tRNA中tRNA的第34位( ac4C34 )和真核生物tRNASer和tRNALeu中的第12位( ac4C12 )存在乙酰化修饰。人们对ac4C34的生化机制、结构基础和功能意义有了深入的了解；然而，尽管ac4C12修饰活性在20世纪60年代被发现，并被鉴定为Kre33 / NAT10和Tan1 / THUMPD1修饰装置，但近60年来，ac4C12修饰活性从未被重建。 2024年4月13日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周小龙团队在Nucleic Acids Research 上在线发表题为“Activity reconstitution of Kre33 and Tan1 reveals a molecular ruler mechanism in eukaryotic tRNA acetylation”的研究论文，该研究成功重组了酵母Kre33和Tan1的ac4C12修饰活性。ac4C12的生物合成主要依赖于一个最小的元件集，包括一个典型的受体茎，11CCG13基序的存在和正确的D臂方向，这表明了一个分子标尺机制。 单个A13G突变赋予ac4C12对多个非底物tRNA的修饰。此外，将ac4C修饰引入到小RNA中，ac4C12修饰在体外和体内对tRNA的解链温度和氨酰化修饰的贡献很小。总之，该结果实现了体外活性重构，揭示了ac4C12生物合成的tRNA底物选择机制，并开发了一个有价值的制备乙酰化tRNA和非tRNA RNA物种的系统，这将促进乙酰化在RNA结构和功能中的功能解释。 RNA上修饰了超过150种不同的化学修饰，统称为RNA RNA表观遗传学。 在各种RNA类别中，转运RNA ( transfer RNAs，tRNAs )具有最广泛和多样的修饰，占鉴定到的修饰的80 % 。 乙酰化是一种普遍存在的转录后修饰，存在于各种类型的RNA [信使RNA ( mRNA )、tRNA和核糖体RNA ( rRNA )]中，遍及生命的所有分支。 迄今为止，已经报道了两个乙酰化残基，N6 -乙酰腺苷( ac6A )和N4 -乙酰胞苷( ac4C )。而ac6A只存在于古菌的tRNAs 中，ac4C则存在于生命体的所有结构域中。ac4C在人类mRNA编码区的优势分布是先前观察到的。之前已经观察到ac4C在人类mRNA编码区的优势分布。然而，最近的一项研究未能在生理条件下鉴定人和酵母mRNA中的ac4C位点。在哺乳动物和酵母的18S rRNA中也发现了ac4C的修饰，它有助于rRNA前体的加工和翻译的准确性。 在细菌tRNA中，ac4C只存在于延伸体甲硫氨酸tRNA的摆动位置(第34位, ac4C34)。 在此位置，乙酰化主要由GCN5相关的乙酰转移酶TmcA催化。因此，ac4C34修饰可以通过TmcA在体外成功重组。对TmcA的生化和结构研究揭示了其催化机理，表明其利用乙酰辅酶A (作为乙酰基供体)和ATP作为底物。此外，最近的一项研究鉴定了枯草芽孢杆菌中负责ac4C34生物合成的甲硫氨酸tRNA胞苷乙酸酯连接酶( TmcAL )。对TmcAL活性的重构发现，TmcAL以乙酸盐为乙酰基供体，其催化机制( tRNA类氨酰化机制)和结构域组成与TmcA完全不同，ac4C34通过确保AUG Met密码子的精确解码，同时防止近同源AUA Ile密码子的误读，对翻译的准确性起着至关重要的作用。 古菌tRNA也存在ac4C修饰，但修饰位点更为多样，覆盖了多种古菌的多个tRNA。 古菌ac4C修饰酶已被鉴定。古菌tRNA ac4C修饰在较高温度下受到刺激，乙酰转移酶缺陷型菌株表现出温度依赖性生长缺陷，表明温度依赖性ac4C生物合成是古菌独特的适应性生存策略。然而，ac4C修饰的缺失对古菌tRNA的熔解温度( Tm )没有影响。迄今为止，有关古菌ac4C修饰酶活性的体外研究尚未见报道。 ac4C水平的改变与多种人类疾病相关，包括炎症、糖尿病、肾衰竭、肺纤维化、多发性硬化症和各种感染。 由于ac4C在mRNA、tRNA和rRNA上的广泛分布，ac4C相关疾病不能仅仅归因于tRNA的低修饰。然而，THUMPD1中的一系列双等位基因变异会损害其活性，并导致ac4C12修饰的丢失。这些变化导致了一种综合征形式的智力残疾，突出了tRNA ac4C12与人类疾病的直接关联。 尽管该领域对细菌ac4C34生物合成的分子机制及其在Met密码子解码中的生物学意义有了较为清晰的认识 ，但目前对真核生物ac4C12修饰的认识，包括修饰机制、tRNA底物选择、结构基础及其对tRNA结构和功能的影响等，仍然非常有限。此外，Tan1 / THUMPD1在ac4C12生物发生中的结构和功能知之甚少。此外，NAT10和THUMPD1致病变异的机制尚不清楚。这些局限性至少部分源于真核生物tRNA ac4C12修饰从未在体外重组。因此，最近一项研究ac4C12对tRNA热力学性质的潜在影响依赖于tRNA D - arm中含ac4C12片段的化学固相RNA合成，但不能利用完整的tRNA。由于未能制备出ac4C12修饰的tRNA，极大地阻碍了对ac4C12在tRNA结构和功能中的分子机制和潜在作用的理解。 文章模式图（图源自Nucleic Acids Research ) 因此，该研究基于已解析和预测的酵母Kre33结构，构建并纯化了一个C -末端柔性结构域( flexible domain，FD )截短的Kre33。 通过Kre33-Tan1活性成功重组了tRNASer和tRNALeu的ac4C12修饰。体外和体内数据表明，Tan1识别tRNA是通过协调的蛋白质- RNA相互作用介导的。现ac4C12至少在体外对tRNA转录本的Tm值没有影响，在体内和体外对tRNASer和tRNALeu的带电水平也没有影响。总之，该结果首次在体外重建了ac4C12的修饰，并提出了真核生物ac4C12生物合成中tRNA底物选择的原则，为进一步研究真核生物ac4C12修饰的分子机制、结构基础和功能意义以及ac4C12相关疾病的分子病因学奠定了坚实的基础。 分子细胞卓越中心博士研究生马春蕊为论文第一作者，分子细胞卓越中心/国科大杭州高等研究院周小龙研究员为论文通讯作者。上海交通大学医学院许泓教授团队参与研究。感谢分子细胞卓越中心分子生物学技术平台李竑博士大力支持。该研究获科技部、国家自然科学基金委、中国科学院、上海市科委的经费资助。 参考消息： https://doi.org/10.1093/nar/gkae228 —END— 内容为【iNature】公众号原创， 转载请写明来源于【iNature】 微信加群 iNature汇集了4万名生命科学的研究人员及医生。我们组建了80个综合群（16个PI群及64个博士群），同时更具专业专门组建了相关专业群（植物，免疫，细胞，微生物，基因编辑，神经，化学，物理，心血管，肿瘤等群）。温馨提示：进群请备注一下（格式如学校+专业+姓名，如果是PI/教授，请注明是PI/教授，否则就直接默认为在读博士，谢谢）。可以先加小编微信号（love_iNature），或者是长按二维码，添加小编，之后再进相关的群，非诚勿扰。 投稿、合作、转载授权事宜 请联系微信ID：13701829856 或邮箱：iNature2020@163.com 觉得本文好看，请点这里！
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