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Nature背靠背｜FOXO1限制CAR T细胞耗竭并增强抗肿瘤活性?

撰文｜风 CAR T （chimeric antigen receptor T cell）是一种生物工程化的免疫细胞，可以特异性识别并杀伤肿瘤细胞。目前，CAR T疗法为肿瘤患者治疗带来革命性治疗甚至治愈的希望（详见BioArt报道：）。然而，在临床治疗过程中发现，超过50%的肿瘤患者在启始有反应的情况下最终复发，尤其是实体瘤对CAR T治疗效果欠佳，制约着CAR T临床应用（详见BioArt报道：）【1,2】。这其中的重要原因就是，CAR T在慢性抗原刺激、代谢竞争和缺乏共刺激信号等压力下形成终末分化状态（详见BioArt报道：）【3】。这种终末分化的CAR T类似于内源性耗竭T细胞，特点是低表达效应分子而高表达免疫检查点分子，如PD-1、LAG-3和TIM-3 【4】。在CAR T治疗患者体内，保持长期功能性存在的CAR T细胞的特征是低分化、干性和记忆性【3,5】。如何维持这种高活性的CAR T是肿瘤治疗的关键挑战。研究显示，T细胞分化与代谢和表观遗传重塑紧密相关。改善氧化磷酸化和促进线粒体功能增强CAR T持久性和功能【6】。既往研究探索多种方法来调节CAR T分化，例如细胞因子、表观调控和过表达转录因子（详见BioArt报道：；；；；）。然而，迄今为止，仍未鉴定出关键转录因子重塑CAR T以增强T细胞代谢适应性，避免细胞耗竭。近日，Nature杂志背靠背在线发表澳大利亚墨尔本彼得麦卡伦癌症中心Phillip K. Darcy研究团队题为 FOXO1 enhances CAR T cell stemness, metabolic fitness and efficacy 的研究文章和美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Evan W. Weber研究团队题为 FOXO1 is a master regulator of memory programming in CAR T cells 的研究文章。这两项独立研究同时鉴定FOXO1作为关键转录因子促进CAR T代谢适应性和干性以及限制耗竭，过表达FOXO1增强CAR T抗肿瘤活性，并为临床优化CAR T应用提供新的方法。之前研究报道IL-15和IL-7刺激的CAR T细胞有更长的持久性，这与改善的代谢适应有关【7】。团队使用IL-15和IL-2分别刺激的CD8+ CAR T行表观遗传组和转录组测序分析，RNA-seq结果显示IL-15引出记忆性相关基因表达，包括Jun、Tcf7、Id3、Foxo1和Klf2。分析IL-15引起的转录组改变发现FOXO1靶基因是最显著的基因富集。在表观遗传水平上，FOXO1也是排名最高的转录因子之一。在CAR T中使用CRISPR-Cas9敲除FOXO1导致CD62L和TCF7的下调，且当与肿瘤细胞共培养时，敲除FOXO1的CAR T显著上调TIM-3、LAG3和PD-1水平，表明敲除FOXO1的CAR T存在一种短期效应样表型。随后，团队在小鼠anti-HER2 CAR T内过表达FOXO1-ADA （FOXO1的组成型激活变体）、TCF7、ID3和JUN。在与E0771-HER2细胞体外多轮培养过程中，相比于WT CAR T，TCF7和FOXO1过表达促进IFNγ和TNF表达；FOXO1过表达促进GZMB表达，表明杀伤能力增强；FOXO1、TCF7、ID3和JUN过表达均会增加CAR T数量和维持CD62L+Ly108+干性表型。之后，在体内E0771-HER2和MC38-HER2模型中，FOXO1、TCF7和ID3过表达CAR T显著延长荷瘤小鼠生存期。荷瘤小鼠肿瘤组织内FOXO1过表达CAR T有更高的IFNγ、GZMB和TNF表达；Ki-67轻微增加；而活化指标TIM-3和PD-1则无明显变化，表明FOXO1过表达并不能影响CAR T获得效应表型。鉴于此，团队同时引入免疫检查点PD-1抑制剂，发现FOXO1过表达和PD-1抑制剂有更好的协同抗肿瘤效果。然而，类似的体内抗肿瘤表型并没有在CD4+ CAR T中发现，可能与肿瘤内CD4+ T细胞浸润低有关。有意思的是，团队发现IFNγ阻断可以废除FOXO1过表达CAR T的强化抗肿瘤效应，表明IFNγ可能赋予上述增强的抗肿瘤功能（Nature | CAR T细胞的杀伤作用需要实体瘤中的IFNγR信号通路）。另外，作者发现FOXO1过表达CAR T的氧化磷酸化增强，且荷瘤小鼠肿瘤组织内的FOXO1过表达CAR T线粒体膜电位和线粒体质量（数量和大小）适应性增加。总之，这些数据表明FOXO1过表达通过促进线粒体生成、增殖和多功能性增强CAR T的抗肿瘤活性。随后，团队在人CAR T细胞研究FOXO1过表达效应。结果发现人CAR T内FOXO1过表达增加CD62L+CD27+和CD45RA+比例，降低LAG3和TIM3表达，表明一种低分化干性状态。然而，和小鼠FOXO1过表达CAR T不同，人FOXO1过表达CAR T在激活后并不能有效转化为效应细胞，IFNγ和TNF表达降低。因此，团队放弃构建FOXO1-ADA持续激活变体，而使用FOXO1-WT构建FOXO1过表达CAR T。的确，FOXO1-WT过表达增加CD62L+CD27+和CD45RA+比例，也能和对照CAR T在肿瘤细胞共培养时分泌相似水平的IFNγ和TNF，因此后续使用FOXO1-WT在人CAR T中评价效应。值得注意的是，FOXO1过表达CAR T在短暂激活和长期慢性刺激下能恢复干性状态。为此，团队分别在转录组层面和表观遗传组层面分析FOXO1过表达CAR T以探究其机制。在转录组层面，FOXO1过表达CAR T表现出增加的低分化T细胞基因表达和降低的免疫检查点水平。另外，相比于对照CAR T，FOXO1过表达CAR T在静息状态下糖酵解基因表达降低，显示干性特征。然而，在激活状态下，FOXO1过表达CAR T糖酵解基因表达显著上调。且在活化后，对照CAR T和FOXO1过表达CAR T在差异基因上明显减少，表明FOXO1可以促进干性的同时不影响效应功能的获取。在耗竭方面，FOXO1过表达CAR T在静息状态下耗竭相关基因表达降低，而在活化时，对照和FOXO1过表达CAR T均上调耗竭分子表达，且无差别。然而，有意思的是，活化的FOXO1过表达CAR T在静息一段时间后，耗竭基因表达下调。与此同时，体外培养CAR T的scRNA-seq也同样证实上述结果。而在表观遗传组层面，FOXO1过表达降低了免疫检查点转录区的染色质可即性，而STAT1和STAT3等调节稳态的基因染色质可即性增加。同时，与前述转录组层面结果一致，FOXO1过表达CAR T在静息状态具有干细胞样表观遗传组特征，而在激活后具有效应样表观遗传组特征。总之，这些数据表明FOXO1-WT过表达促进干细胞样表型，但不影响T细胞活化相关效应的获得。最后，作者在体内验证人FOXO1过表达CAR T的抗肿瘤特性。令人兴奋的是，FOXO1过表达Lewis Y CAR T显著降低小鼠OVCAR-3肿瘤负担。肿瘤内浸润的FOXO1过表达CD8+ CAR T增多，此外，不仅具有低分化特征，且耗竭相关分子表达也显著降低。之后，团队直接分离病人体内的CAR T，经过FOXO1过表达后转入OVCAR-3荷瘤小鼠体内，同样发现上述结果。这些数据表明FOXO1过表达可以增强人CAR T的干性和抗肿瘤效果。在另外一篇背靠背文章中，Evan W. Weber团队在敲除和过表达FOXO1的CAR T细胞内使用RNA-seq、scRNA-seq、ATAC-seq和seahorse等技术同样鉴定FOXO1作为关键的转录因子促进CAR T的记忆潜能和代谢适应，并降低耗竭分子表达以促进抗肿瘤反应。综上所述，这两项研究均揭示FOXO1在促进CAR T干性、代谢适应性和记忆性以及降低耗竭以促进其抗肿瘤活性的关键作用，这些发现为工程化CAR T以获得更强更持久的临床效果带来新的突破和见解。同期，Nature杂志在线发表题为 How to supercharge cancer-fighting cells: give them stem-cell skills 的述评新闻稿。原文链接： https://doi.org/10.1038/s41586-024-07242-1 https://doi.org/10.1038/s41586-024-07300-8 制版人：十一参考文献 1. Evan W, Weber., Marcela V, Maus., Crystal L, Mackall.(2020). The Emerging Landscape of Immune Cell Therapies. Cell, 181(undefined), 0. doi:10.1016/j.cell.2020.03.001 2. Sherly, Mardiana., Benjamin J, Solomon., Phillip K, Darcy., Paul A, Beavis.(2019). Supercharging adoptive T cell therapy to overcome solid tumor-induced immunosuppression. Sci Transl Med, 11(undefined), 0. doi:10.1126/scitranslmed.aaw2293 3. Jack D, Chan., Junyun, Lai., Clare Y, Slaney., Axel, Kallies., Paul A, Beavis., Phillip K, Darcy.(2021). Cellular networks controlling T cell persistence in adoptive cell therapy. Nat Rev Immunol, 21(undefined), 0. doi:10.1038/s41577-021-00539-6 4. Christian U, Blank., W Nicholas, Haining., Werner, Held., Patrick G, Hogan., Axel, Kallies., Enrico, Lugli., et al.(2019). Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol, 19(undefined), 0. doi:10.1038/s41577-019-0221-9 5. Joseph A, Fraietta., Simon F, Lacey., Elena J, Orlando., Iulian, Pruteanu-Malinici., Mercy, Gohil., Stefan, Lundh., Alina C, Boesteanu., Yan, Wang., et al.(2018). Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nat Med, 24(undefined), 0. doi:10.1038/s41591-018-0010-1 6. Jaco A C, van Bruggen., Anne W J, Martens., Joseph A, Fraietta., Tom, Hofland., Sanne H, Tonino., Eric, Eldering., Mark-David, Levin., et al.(2019). Chronic lymphocytic leukemia cells impair mitochondrial fitness in CD8(+) T cells and impede CAR T-cell efficacy. 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