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Mol Cell | RNA聚合酶II回溯表征新方法及对基因表达的调控
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撰文 | SLS 不论在真核细胞还是细菌中，RNA聚合 酶II (RNA Pol II) 在转录过程中能够发生 回溯 (backtracking) ，这一过程参与基因表达水平的调控和DNA修复。Pol II的回溯导致部分新转录出的RNA 3‘端从Pol II伸出，这一部分能够被转录因子IIS （TFIIS） 切割从而恢复正常的转录。TFIIS切割的效率和时间的不同会导致短暂的转录暂停或者长时间的转录停滞。为了表征整个基因组中回溯的情况，研究者曾利用mNET-seq通过比较野生型和TFIIS失活的细胞中新转录出的RNA位点，发现了回溯发生的基因和位点。然而该方法依赖内源TFIIS活性，只能灵敏地检测短暂的Pol II回溯，而无法检测持久的Pol II回溯。 近日，纽约大学 （NYU） 的Evgeny Nudler课题组在Molecular Cell期刊上在线发表了题为 Persistence of backtracking by human RNA polymerase II 的文章，研究者 开发了一套新的测序方法（LORAX-seq），系统地探究Pol II持久回溯的情况，揭示了Pol II回溯对于基因表达的影响。 基于mNET-seq，LORAX-seq同样纯化了与Pol II结合的新转录的RNA，但在此基础上用体外重组的TFIIS处理纯化后的RNA，更有效地对持久回溯的RNA进行切割。对切割下来的RNA片段纯化建库后测序发现，相较于未进行TFIIS处理的对照，更多的测序片段对齐在基因编码区。这些回溯的RNA片段长度在20-40bp左右，且测序结果重复性强。mNET-seq可以检测Pol II在基因组上暂停的位点 （pause） ，LORAX-seq检测到的的持久回溯位点与Pol II暂停位点有一定重合，然而Pol II暂停的测序信号强度与回溯的信号强弱无关。相比于野生型的细胞，TFIIS敲除之后通过LORAX-seq能够检测到更多的回溯信号。 Pol II的回溯也表明这些位置附近可能存在Pol II的结合。为了验证这一假设，研究者首先用4-sU标记新合成的RNA并与Pol II进行交联，然后利用RNase I 足迹法 （footprinting） 去测序被Pol II保护的RNA片段，与LORAX-seq的3‘信号相比，Pol II足迹的3’信号理论上应在上游10-20bp左右。测序结果显示，不论是代表基因NPM1还是整个基因组的足迹信号都与mNET-seq的Pol II暂停位点重合，且也在LORAX-seq的回溯信号的上游有一定的分布，甚至有30-40bp。这些结果再一次确认了mNET-seq检测到的Pol II暂停与回溯位点的区别，证实体内存在稳定而且远距离的Pol II回溯过程。 为了更好地在基因组上表征这些稳定回溯的位置，研究者对mNET-seq和LORAX-seq的结果进行了综合分析。结果显示， 在基因的转录起始位点（TSS）下游250bp附近有很强的回溯信号 ，而且回溯在顺义和反义链都能检测到；然而在转录终止位点 （TES） 附近却没有明显的信号。此外， 在外显子-内含子的边界的5‘剪切位点（5’ss）同样检测出了很强的回溯信号，而在3‘剪切位点（3’ss）的下游外显子上（~40bp）也有明显的回溯信号，这些结果暗示共转录的RNA剪切过程伴随着Pol II的回溯。 为探究Pol II回溯对基因表达的影响，研究者对野生型和TFIIS缺失的细胞分别进行了RNA测序，结果表明相比于野生型，TFIIS敲除的细胞中多数发生Pol II回溯的基因的表达量下调，表明未恢复的Pol II回溯会降低基因表达。这些下调的基因参与翻译，核小体组装，调控细胞周期和发育过程，并在许多热休克蛋白和转录因子的基因上也看到了Pol II回溯。 组蛋白基因是Pol II回溯信号最强的基因。为了探究Pol II回溯对于组蛋白的调控，作者分别对野生和TFIIS敲除的细胞进行周期同步化处理，再解除同步。结果表明，在敲除的细胞中，组蛋白基因H2AC20表达量显著低于对照，在其他和细胞复制相关的组蛋白基因上也观察到了类似的结果，这也导致敲除的细胞复制时间较长。研究者进一步进行了挽救实验，发现只有野生的TFIIS能够促进敲除细胞的组蛋白的表达。对解除同步的细胞进行LORAX-seq的结果显示，野生细胞的组蛋白基因上Pol II回溯信号明显升高，这可能是因为转录水平上升导致的，而TFIIS敲除的细胞Pol II回溯并没有明显变化。这些结果表明在组蛋白基因上的Pol II回溯能够阻碍正常的基因表达和复制。 总而言之，作者 利用重组的TFIIS开发了能够系统表征Pol II回溯的测序方法LORAX-seq，发现Pol II回溯主要发生在转录起始位点和RNA剪切位点附近，而且未恢复的Pol II回溯能够下调基因的复制和转录。 原文链接： https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(24)00055-8 制版人：十一 转载须知 【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。 BioArt Med Plants 人才招聘 会议资讯 近期直播推荐
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