细胞环境对单个蛋白质的影响导致蛋白质形成五级结构。为了探究这一现象,研究者们通常在可控的人工条件下,将细胞内测量和体外测量结合起来进行研究。电子顺磁共振(EPR)光谱是细胞内探索蛋白质结构和动力学的有效方法。细胞内蛋白质和核酸的EPR结构研究一般用氮氧自由基标记,然而,该标记物对细胞还原具有敏感性。钆(Gd (III))和三线态自旋标记可对二电子体系电子共振(DEER)进行距离测量,该标记虽然具有更高的细胞内稳定性,但缺乏提供自旋标记动力学信息的能力。因此,蛋白质的正交氮氧化物- Gd (Ⅲ)标记,综合利用两种标记方法的优点,理论上可以获得样品的结构和动态信息。
以色列魏茨曼科学研究所的Daniella Goldfarb等人应用连续波(CW) EPR和二电子体系电子共振(DEER)方法,探索了结构良好的球状蛋白PpiB在大肠杆菌细胞中的结构和动力学。在该研究中,作者使用了多种标记物,包括具有抗还原性的自旋标记M- TETPO (Karthikeyan et al , 2018)以及与Gd(III)结合的非天然氨基酸。
通过x波段CWEPR观察到,与溶液中相比,细胞中两个标记位置(25位于螺旋上,153位于环上)的氮氧化物自旋标记旋转扩散速率显著降低,作者用拥挤剂和大肠杆菌细胞裂解液模拟这种效应,未能重现其局部流动性的显著变化。由于Ppi B (K25C/V155O) Azido-Gd (III)/M-TETPO在高浓度下析出,无法获得足够的细胞内蛋白标记信号,所以细胞内DEER测量实验则采用Gd(III)自旋标记。研究结果显示,大肠杆菌内距离分布范围比溶液或HeLa细胞中更广,这说明大肠杆菌细胞中存在的Ppi B构象数量增加,原因可能是Ppi B与其他细胞组分的相互作用,导致存在五级结构以及局部拥挤环境。这些相互作用也是氮氧化物标记不同构象之间交换速率降低的原因。总之,该项研究是EPR光谱技术研究蛋白的结构和动力学的一次成功应用。该研究成果以“Exploring the dynamics and structure of PpiB in living Escherichia coli cells using electron paramagnetic resonance spectroscopy”为题,于2024年2月发表在《蛋白质科学》上。